Centrum Algatech

Mikrobiologický ústav AV ČR, v.v.i. - vědecké pracoviště Třeboň

Analýza metabolitů

Analýza primárních i sekundárních metabolitů

Naše laboratoř se zabývá výskytem a analýzou bioaktivních látek a toxinů především ze sinic. Mezi takové látky se nejčastěji řadí sinicové peptidy (např. mikrocystiny, nodulariny, puwainaphyciny, aeruginosiny atd.), ale též alkaloidy, polyketony atd. Právě tyto sloučeniny jsou zpravidla velmi dobře analyzovatelné spojením vysokoúčinné kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (HPLC-MS).

Separace sekundárních metabolitů ze surových extraktů probíhá nejčastěji na reverzní fázi pomocí kapalinové chromatografie. Jednotlivé sloučeniny se detekují a identifikují pomocí DAD a MS detektorů.

Naše laboratoř disponuje třemi HPLC-MS sestavami, z toho dvě jsou analytické a jedna preparativní. Nejstarší HPLC-MS sestavou je kapalinový chromatograf připojen k hmotnostnímu spektrometru využívající ionizaci elektrospejem (ESI) (případně chemickou ionizaci - APCI) a 3D iontovou pastí jako analyzátorem. Ačkoli detektor nabízí nízké rozlišení, princip 3D iontové pasti umožňuje získat fragmentaci n-tého stupně, což významně přispívá k určení struktury neznámé sloučeniny. Další analytickou sestavou je opět kapalinový chromatograf s DAD detektorem připojený k hmotnostnímu spektrometru s ionizací ESI (případně APCI) a analyzátorem doby letu (TOF). Tato detekce umožňuje získat m/z sloučenin s vysokým rozlišením, což umožňuje určení sumárního vzorce sloučeniny. Díky vysokému rozlišení je určování struktury neznámých sloučenin jednodušší. Pro izolaci konkrétních sloučenin ve větším množství slouží třetí LC-MS sestava, která je preparativní, má automatický sběrač frakcí, který může jímat jednotlivé frakce také podle UV-Vis či MS odezvy.

Díky těmto technikám byla naše laboratoř schopná izolovat a určit strukturu celé řady biologicky aktivních sloučenin, jako je např. nostotrebin, aeruginosin-865, puwainaphycin F/G atd.

Mezi nejnovější analytickou metodu používanou v naší laboratoři patří spojení plynového chromatografu, chemické ionizace a hmotnostního spektrometru s vysokým rozlišením (GC-APCI-HRMS). Tato metoda se využívá zejména pro metabolomické studie. Derivatizované vzorky jsou separovány pomocí plynové chromatografie a následně analyzovány pomocí hmotnostního spektrometru s vysokým rozlišením.

Přístrojové vybavení

  • Preparativní sestava Agilent 1620 Infinity purification system s MWD a MS detekcí (kvadrupól), autosamplerem a frakčním kolektorem.
  • Analytická sestava Agilent 1100 LC/MSD Trap s PDA detekcí a MS detekcí (3D iontová past) a autosamplerem (ESI a APCI ionizace).
  • Analytická sestava Thermo Dionex 3000 s PDA detekcí propojená s hmotnostním spektrometrem Bruker Daltonic s HRMS detekcí (ESI a APCI ionizace, analyzátor qTOF).
  • Sestava GC-APCI-HRMS, plynový chromatograf Thermo, APCI ionizace a HRMS detekce od firmy Bruker Daltonic.
  • Protiproudá vytřepávací chromatografie (CCC)
  • Iontový chromatograf

V rámci smluvního či partnerského výzkumu a servisních analýz můžeme nabídnout

  • Detekce a potvrzení přítomnosti známých sloučenin, které lze analyzovat LC-MS technikami (zejména sekundárních metabolitů sinic)
  • Kvalitativní a kvantitativní analýza sinicových toxinů (mikrocystiny RR a LR, anatoxin, cylindrospermopsin)
  • Selektivní vyhledávání mikrocystinů a nodularinů v surových extraktech biomasy
  • Selektivní vyhledávání některých druhů bakteriálních lipopeptidů
  • Ověření čistoty sloučenin
  • Určení sumárního vzorce neznámých sloučenin, interpretace MS2 spekter
  • Izolace sloučenin pomocí protiproudé vytřepávací chromatografie (řádově jednotky gramů)
  • Izolace sloučenin pomocí preparativní HPLC (řádově desítky mg)

 

V případě zájmu o tyto služby kontaktujte: hrouzekp@gmail.com (Pavel Hrouzek), urajova@alga.cz (Petra Urajová, mateřská dovolená); pro CCC kontaktujte: Dr. Jose Cheel, PhD. (skupina Jiřího Kopeckého)

Lidé: Pavel Hrouzek, Dai Long Vu, Petra Urajová, Jan Hájek