Chlorofyl má jako součást fotosyntetických komplexů zcela zásadní význam pro život na naší planetě. Díky unikátním chemickým vlastnostem chlorofylu dokáží fotosyntetické organismy využívat vodu jako nekonečný zdroj elektronů pro svůj metabolismus v procesu zvaném oxygenní fotosyntéza.
Chemicky je chlorofyl tetrapyrol a počátek jeho biosyntézy je shodný s biosyntetickou dráhou ostatních tetrapyrolů v buňce, jako je hem či vitamín B12. Celá biosyntetická dráha chlorofylu je tedy značně komplikovaná a přestože jednotlivé biochemické reakce a meziprodukty jsou známé, mechanismus jakým fotosyntetická buňka kontroluje množství produkovaného hemu a chlorofylu je nejasný. Nicméně podle současného stavu poznání je striktní regulace této metabolické dráhy určitým "neuralgickým bodem" fotosyntetické buňky; nedostatek chlorofylu limituje syntézu obou fotosystémů a specificky také opravu fotosystému II, což může vést až k úplnému zničení buňky. Na druhou stranu, hromadění chlorofylu nebo jeho prekurzorů je pro buňku toxické s podobně fatálními důsledky.
Klíčovým enzymem regulujícím celkovou produkci všech tetrapyrolů v buňce se jeví glutamyl-tRNA syntáza (GluTR), první enzym celé metabolické dráhy. Náplní projektu bude zjistit, jak je tento enzym post-translačně regulován. V případě doktorského studia půjde o projekt s širokým metodickým záběrem. Bude zahrnovat purifikaci jak GluTR, tak dalších enzymů pomocí proteinových kotev za nativních podmínek, přípravu funkčních rekombinantních enzymů a in vitro metody na měření aktivity GluTR. Součástí bude i značení de novo vyrobeného Chl pomocí izotopů uhlíku, 2D separace proteinů, HPLC pigmentů, hmotnostní spektrometrie a další.
V případě magisterského projektu bude podle zájmu studenta vybrána jedna část jako vlastní menší projekt - purifikace 3xFLAG-tagovaného enzymu a následná detailní analýza nativního komplexu, in vitro assay na měření aktivity GluTR apd.
Enzym uroporphyrinogen III syntáza se v biosyntetické dráze tetrapyrolů (viz. projekt výše) nachází v místě větvení mezi syntézou hemu/chlorofylu a syntézou vitamínu B12 a sirohemu. Naše současná data naznačují, že toto větvení by mohlo hrát významnou úlohu v regulaci celé dráhy jako případný „přepad" v případě, kdy je pro buňku nutné výrazně a rychle utlumit syntézu chlorofylu. Obecně je hromadění metabolitů v syntéze chlorofylu pro buňky toxické a tato toxicita je dále násobena za stresových podmínek jako jsou například náhlé výkyvy v intenzitě světla. Cílem projektu je identifikovat regulační faktory (proteiny), které interagují s uroporphyrinogen III syntázou. Úkolem studenta bude v prvním kroku připravit kmen sinice Synechocystis exprimující uroporphyrinogen III syntázu fůzovanou s 3xFLAG kotvou. Následně bude tento enzym purifikován za nativních podmínek a případný komplex s dalšími proteiny pak bude analyzován pomocí 2D elektroforézy, hmotnostní spektrometrie a dalších metod.